Unter der Leitung von Chemiker Professor Philip Tinnefeld von der Ludwigs-Maximilians-Universität München (LMU) und in Kooperation mit Professor Fernando Stefani, Fachbereich Physik der Universität von Buenos Aires (UBA), Buenos Aires, Argentinien, haben Forschende der LMU mittels pMINFLUX multiplexing einen eleganten Ansatz entwickelt, um traditionelle Auflösungsgrenzen der Fluoreszenzmikroskopie für das schnelle Tracken von Molekülen zu überwinden.
Die innovative Methode pMINFLUX verfolgt schnelle dynamische Prozesse zwischen Molekülen auf molekularer Ebene. Das war bisher nicht möglich, da mehrere eingesetzte Farbstoffe für Anwendungen, in denen schnelle dynamische Prozesse untersucht werden, nicht gleichzeitig lokalisiert werden können. Das verschlechterte die zeitliche Auflösung bei der Untersuchung dieser dynamischer Prozesse, die unter Beteiligung mehrerer Biomoleküle stattfinden, erheblich.
Unter der Leitung von LMU-Chemiker Professor Philip Tinnefeld und in Kooperation mit Professor Fernando Stefani (Buenos Aires) haben Forschende der LMU mittels pMINFLUX multiplexing nun einen eleganten Ansatz entwickelt, um dieses Problem zu lösen.
MINFLUX ist eine super-auflösende Mikroskopiemethode, die Lokalisationen mit Präzisionen von nur einem Nanometer ermöglicht. Im Gegensatz zu konventionellem MINFLUX registriert das entwickelte pMINFLUX die Zeitdifferenz zwischen der Anregung der Farbstoffe mit einem Laserpuls und der daraus folgenden Fluoreszenz in Sub-Nanosekunden-Auflösung. Das ermöglicht neben ihrer Lokalisation Einblicke in eine grundlegende Eigenschaft der Fluoreszenzfarbstoffe: ihre Fluoreszenzlebensdauer. Diese beschreibt, wie lange es im Schnitt dauert, bis ein Farbstoffmolekül nach seiner Anregung fluoresziert.
„Die Fluoreszenzlebensdauer hängt vom verwendeten Farbstoff ab“, erklärt Fiona Cole, Erstautorin der Publikation. „Wir haben Unterschiede in der Fluoreszenzlebensdauer bei Verwendung verschiedener Farbstoffe genutzt, um die Fluoreszenz den unterschiedlichen Farbstoffmolekülen zuzuordnen, ohne dass ein Blinken und eine damit verbundene zeitliche Trennung nötig ist“.
Die Forschenden adaptierten hierfür den Lokalisierungsalgorithmus und bauten ein multiexponentielles Fit-Model ein, um die gewünschte Auftrennung zu erreichen. „Das hat uns erlaubt, die Position mehrerer Farbstoffe gleichzeitig zu bestimmen und so schnelle dynamische Prozesse zwischen mehreren Molekülen mit nanometergenauen Präzisionen zu untersuchen“, fügt Jonas Zähringer, ebenfalls Erstautor, hinzu.
Die Forschenden demonstrierten ihre Methode durch das genaue Tracken zweier DNA-Stränge während des Wechsels zwischen verschiedenen Positionen auf einer DNA-Origami-Nanostruktur, die Auftrennung von Translations- und Rotationsbewegungen einer DNA-Origami-Nanostruktur und die Messung des Abstandes zwischen den Antigen-Anbindestellen von Antikörpern.
„Das ist jedoch erst der Anfang“, so Philip Tinnefeld. „Ich bin mir sicher, dass pMINFLUX multiplexing mit seiner hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung in Zukunft neue Erkenntnisse über Proteininteraktionen und andere biologische Phänomene liefern wird."